獼猴桃屬植物的遺傳多樣性及種質(zhì)超低溫保存研究
徐小彪
【摘要】：中國是獼猴桃屬植物的起源和分布中心，種質(zhì)資源極為豐富，可為獼猴桃遺傳改良和資源利用提供廣泛的背景材料。長期以來，對獼猴桃屬植物的遺傳多樣性尤其是DNA水平上的遺傳多樣性及種質(zhì)的超低溫保存缺乏系統(tǒng)研究。鑒于此，作者以重要分布區(qū)之一的江西獼猴桃屬植物為對象，在查清其種類、分布及若干性狀評價(jià)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行AFLP分析與種質(zhì)超低溫保存的研究。主要結(jié)果如下： 1 江西獼猴桃屬植物的分布及若干性狀評價(jià) (1) 通過野外實(shí)地調(diào)查與查閱標(biāo)本，對江西獼猴桃屬(Actinidia)植物的分布狀況進(jìn)行系統(tǒng)研究，基本查清了其分布種類及規(guī)律。結(jié)果表明，江西境內(nèi)分布有獼猴桃屬植物20種11變種，其中葛棗獼猴桃(Actinidia．polygamya(Sieb．et Zucc．)Maxim．)、灰毛獼猴桃(A．cinerascens C．F．Liang)、楔葉獼猴桃(A．fasciculoides var cuneata C．F．Liang)和簇花獼猴桃(A．fasciculoides C．F．Liang)為江西首次發(fā)現(xiàn)。依據(jù)其種類與變種的多樣性形態(tài)特征，編制了江西獼猴桃屬植物分類檢索表。 (2) 江西獼猴桃屬植物的地理分布區(qū)域較廣，中華獼猴桃在全省各地均有分布，各種類與變種之間對氣候及土壤等生態(tài)條件要求的多樣性導(dǎo)致其地理分布的廣泛性。其區(qū)系特征主要表現(xiàn)為：種類豐富，特有現(xiàn)象較明顯，江西分布國有特產(chǎn)種17種，占國產(chǎn)該屬特有種的30.4％，其中有2種為江西特有：種間、種內(nèi)分化較強(qiáng)烈，江西獼猴桃屬植物的種與變種在該屬4個組均有代表：與鄰近地區(qū)獼猴桃屬植物的關(guān)系密切，其中與福建關(guān)系最為密切。 (3) 通過對主要種與變種果實(shí)性狀觀測、營養(yǎng)成分和氨基酸含量測定，表明江西獼猴桃屬植物在果實(shí)形狀、毛被狀況、果皮色澤、果肉色澤、果實(shí)風(fēng)味、果實(shí)Vc含量及氨基酸含量方面存在豐富的多樣性。 (4) 對江西獼猴桃屬植物中的矮型(贛獼5號)和耐貯(97-3)中華獼猴桃特異種質(zhì)資源進(jìn)行了初步研究，為其保存與利用奠定基礎(chǔ)。 2 獼猴桃屬植物的AFLP分析 (1) 4種經(jīng)優(yōu)化的獼猴桃基因組DNA提取方法即CTAB區(qū)室法、SDS區(qū)室法、CTAB常規(guī)法、SDS常規(guī)法均適于提取獼猴桃嫩葉基因組DNA。經(jīng)綜合對比分析，認(rèn)為CTAB區(qū)室法為獼猴桃屬植物AFLP分析的最佳方法，其步驟簡單、快捷，抽 提的基因組DNA降解少、雜質(zhì)含量少，能獲得高質(zhì)量的DNA模板。通過對所得到 的DNA模板進(jìn)行AFLP分析，獲得了清晰的DNA指紋圖譜。 (2)從AFLP試劑盒所提供的64對引物組合中篩選出擴(kuò)增帶信號強(qiáng)度一致性 好、條帶分布均勻、多態(tài)性高的4對引物組合即E一從C+M--CAC、E一從G+MweCTG、 E一AAC十M--以G和E一從C+M一CTA對31份稱猴桃種質(zhì)進(jìn)行了DNA指紋分析。4對引 物共得到擴(kuò)增位點(diǎn)190個，其中多態(tài)性位點(diǎn)179個，多態(tài)性比例為94.2%，區(qū)分 率達(dá)100%。該4對引物適用于稱猴桃屬植物的AFLP分析。各種質(zhì)的多態(tài)性帶數(shù) 存在差異，多態(tài)性帶數(shù)最多的是黑蕊稱猴桃(108條)，多態(tài)性比例為60.3%;多 態(tài)性帶數(shù)最少的是早鮮稱猴桃(54條)，其多態(tài)性比例為30.2%。結(jié)果進(jìn)一步顯示， 稱猴桃屬植物在DNA分子水平上存在豐富的遺傳多樣性。 (3)首次運(yùn)用AFLP技術(shù)構(gòu)建了31份稱猴桃種質(zhì)的DNA指紋圖譜，通過對擴(kuò) 增結(jié)果進(jìn)行UPGMA聚類分析，其相似系數(shù)為0.50一0.85，表明種質(zhì)之間遺傳關(guān)系 較遠(yuǎn)。依相似系數(shù)0.56的水平，將供試的31份稱猴桃種質(zhì)分為4個類群:凈果 組和斑果組為一類群，糙毛組為一類群，星毛組為一類群，中華稱猴桃和美味稱 猴桃為一類群，該結(jié)果與傳統(tǒng)的果面毛被特征和皮孔狀況的形態(tài)分類系統(tǒng)中組的 劃分大體一致，并有按地理分布聚類的趨勢。AFLP的分子分類可彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài) 分類系統(tǒng)的不足，其分類范圍更細(xì)，可為稱猴桃屬植物的分類提供依據(jù)。 (4)聚類分析表明，稱猴桃屬植物矮型種質(zhì)“贛稱5號”獨(dú)立于中華稱猴桃 種，基于AFLP指紋，從分子水平上分析，可提升為稱猴桃屬中華稱猴桃種內(nèi)的 一個變型。 3稱猴桃種質(zhì)超低溫保存研究 (1)以“贛稱5號”為試材，篩選了其離體培養(yǎng)的激素組合。MS+B凡.0+NAAo.， 與MS+BAI.砰NAAo.l較適于稱猴桃外植體的誘導(dǎo)及增殖。無菌小芽在MS+I BA10 培養(yǎng)基上出根率較高，根系生長正常。 (2)稱猴桃的組培苗每4周繼代一次，在增殖培養(yǎng)基上連續(xù)繼代3一5次后轉(zhuǎn) 入到低濃度生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上繼代一次，然后繼續(xù)增殖。生根試管苗經(jīng)煉苗 移栽后可達(dá)到91%的成活率。 (3)首次采用玻璃化法保存了稱猴桃種質(zhì)離體莖尖，其適宜的程序?yàn)?繼代 20d的1。m長嫩梢，接種到含蔗糖3%的MS培養(yǎng)基上，5℃低溫下鍛煉6周。切 取1.5硯.51nlll的莖尖，于5%DMSO+5%蔗糖+MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d，在 室溫下用Zm。比Gly+0.4m。比蔗糖預(yù)處理30而n，再于O℃下用PvS之脫水處理 4偽nin，換一次新鮮的PVSZ溶液后，迅速投入到LN中。保存24h后，在40℃ 水浴中化凍，用3%蔗糖+MS基本培養(yǎng)基洗滌兩次后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基上，可 獲得56.7%的成活率和51石%的再生率。超低溫保存后的稱猴桃無菌小苗在形態(tài) 上與對照一致。 (4)應(yīng)用流式細(xì)胞儀和TEM對超低溫保存后的材料進(jìn)行倍性檢測以及超低溫 保存過程中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。結(jié)果表明，其染色體倍性未發(fā)生變異。 在含3%蔗糖的MS培養(yǎng)基上，5℃

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