劉蕓宏
【摘要】：獼猴桃潰瘍病是細(xì)菌性疾病,已嚴(yán)重危害到了中國(guó)乃至全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,已經(jīng)成為了全國(guó)森林植物的重點(diǎn)檢疫對(duì)象。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)是引發(fā)獼猴桃潰瘍病的病原菌,Psa-V(Pseudomonas syringae pv.actinidiae virulent strains)是Psa中的強(qiáng)毒株,致病力強(qiáng),是導(dǎo)致我國(guó)獼猴桃潰瘍病爆發(fā)的主要病原菌。獼猴桃花粉攜帶Psa-V是導(dǎo)致其遠(yuǎn)距離傳播的重要因素。因此加大對(duì)獼猴桃花粉中Psa-V檢測(cè)力度對(duì)防止獼猴桃潰瘍病的發(fā)生具有比較重要的意義。本研究采用普通PCR對(duì)陜西獼猴桃花粉樣品進(jìn)行Psa-V檢測(cè),并建立利用PMA-qPCR以及RT-PCR對(duì)Psa-V活菌進(jìn)行檢測(cè)的方法,為花粉消毒,減少花粉傳播Psa-V提供技術(shù)支撐。主要結(jié)果及結(jié)論如下:1.陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)商品花粉中Psa-V普通PCR檢測(cè)抽取36份商品花粉樣品采用普通PCR進(jìn)行Psa-V檢測(cè)。結(jié)果表明,共有27個(gè)樣品結(jié)果呈陽(yáng)性,陽(yáng)性概率為75%,對(duì)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行測(cè)序分析可得出,呈現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果的27個(gè)樣品均為Psa-V。2.基于PMA-qPCR的Psa-V活菌檢測(cè)將疊氮溴化丙啶(PMA)與實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)相結(jié)合,建立陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌定量檢測(cè)方法。通過(guò)優(yōu)化PMA最佳濃度、暗育時(shí)間、曝光時(shí)間,確定PMA-qPCR區(qū)別潰瘍菌活、死菌的最佳條件,結(jié)果表明,Psa-V經(jīng)98.3℃沸水浴處理13 min可完全致死,Psa-V死菌濃度為1×107 CFU/mL時(shí)PMA與死菌共價(jià)交聯(lián)的最佳濃度為105 ug/mL,最佳暗育時(shí)間為8 min,最佳曝光時(shí)間為20min,在此條件下死菌DNA無(wú)擴(kuò)增,而對(duì)活菌DNA擴(kuò)增無(wú)影響;Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的線性回歸方程是Y=-3.2204x+37.73,R2=0.9955,最低可檢出6.39×102拷貝/反應(yīng)體系的Psa-V;檢測(cè)限為2.38×102拷貝/μL反應(yīng)體系;應(yīng)用人工染菌后的枝條樣品檢測(cè),則最低檢出限是6.30×104 CFU/mL,與菌落計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果相符。3.基于RT-PCR的Psa-V活菌檢測(cè)應(yīng)用RT-PCR技術(shù),建立陜西獼猴桃產(chǎn)區(qū)Psa-V活菌檢測(cè)方法。結(jié)果表明,RT-PCR法可有效檢測(cè)出Psa-V活菌,在純培養(yǎng)物中,最小檢出限為1.26×104拷貝/μL反應(yīng)體系;對(duì)于染菌花粉樣品,增菌12h,靈敏度可達(dá)1.39×101 CFU/g。

（獼猴桃花粉）

（獼猴桃雄花粉）